热疗对巨噬细胞M2极化作用及其对肺癌细胞侵袭、迁移影响的体外实验研究

doi:10.12114/j.issn.1007-9572.2021.00.518

摘要/Abstract

摘要： 背景　热疗是一种安全的辅助治疗方法，通过抑制肿瘤细胞DNA修复、促进其凋亡、提高机体免疫等作用阻碍其发生、发展。但是，对于热疗是否可以通过干预巨噬细胞间接影响肿瘤细胞的研究并不多。目的　通过体外模拟热疗产生的温热作用，探讨在热疗条件下M2型肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞（LLC）的调控作用。方法　本研究于2019年6—12月实施。10 000 ng/L的干扰素γ（INF-γ）和100 000 ng/L的脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞48 h成为M1型巨噬细胞，20 000 ng/L 白介素（IL）-4诱导RAW264.7细胞48 h成为M2型巨噬细胞；通过流式细胞术和ELISA法分别检测M1、M2巨噬细胞表面标志抗原CD86、CD206的表达率和细胞因子IL-10、IL-12的分泌水平；采用CCK-8法检测不同热疗温度（41 ℃、42 ℃、43 ℃）干预对M2型巨噬细胞在24 h、48 h和72 h的增殖活性作用；采用实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-PCR）检测M0、M2型巨噬细胞及热疗（42 ℃）后M2型巨噬细胞Arg-1、Fizz-1、Ym-1 mRNA相对表达水平；Western blotting法检测M2型巨噬细胞及热疗（42 ℃）后M2型巨噬细胞Arg-1、Fizz-1、Ym-1蛋白相对表达水平；Transwell法检测LLC+M2、LLC+M2+热疗（42 ℃）中LLC的侵袭、迁移能力。结果　IFN-γ和LPS可诱导RAW264.7细胞向M1型极化，IL-4可诱导RAW264.7细胞向M2型转化。流式细胞术检测结果显示，M2型巨噬细胞CD86、CD206的表达率高于M0型巨噬细胞和M1型巨噬细胞（P<0.001）。ELISA法检测结果显示，M2型巨噬细胞IL-10的分泌水平较M0、M1型巨噬细胞高（P<0.001）；M1型巨噬细胞IL-12分泌水平较M0、M2型巨噬细胞高（P<0.001）。CCK-8法检测结果显示，42 ℃时热疗抑制巨噬细胞的能力高于41 ℃及43 ℃时（P<0.001）。RT-PCR检测结果显示，与M0型巨噬细胞相比，M2型巨噬细胞的Ym-1、Arg-1、Fizz-1 mRNA相对表达水平升高（P<0.001）。热疗（42 ℃）后M2型巨噬细胞的Ym-1、Arg-1 mRNA和蛋白相对表达水平降低（P<0.001）。Transwell法检测结果显示，M2型巨噬细胞与LLC共培养后LLC侵袭、迁移数量增加（P<0.001）；热疗（42 ℃）后LLC侵袭、迁移数量减少（P<0.001）。结论　热疗可能通过下调M2型巨噬细胞的Arg-1、Ym-1 mRNA的表达水平从而抑制LLC的侵袭与迁移能力。

关键词: 肺肿瘤, 肿瘤, 热疗, RAW264.7, 巨噬细胞极化, 体外培养技术

Abstract: Background　Hyperthermia is a safe adjuvant therapy that can suppress the occurrence and progression of tumor cells by inhibiting DNA repair，promoting cell apoptosis and improving immunity．However，little is known about whether hyperthermia can indirectly affect tumor cells by interfering with macrophages．Objective　This study aimed to examine the regulatory efficacy of M2 macrophages on lung cancer cells（LCCs）under in vitro hyperthermia．Methods　This study was implemented from June to December，2019．RAW264.7 cells were stimulated with interferon-γ（INF-γ，10 000 ng/L）+lipopolysaccharide（LPS，100 000 ng/L），and interleukin-4（IL-4，20 000 ng/L）for 72 h to induce M1 and M2 macrophages，respectively．The expression of surface antigens CD86 and CD206 in M1 and M2 macrophages were evaluated by flow cytometry．Secretion levels of IL-10 and IL-12 were measured by ELISA．Then，CCK-8 assay was used to detect the proliferation inhibition of M2 macrophages at 24，48 and 72 h after hyperthermia at different temperatures of 41℃，42℃ and 43℃．Real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blotting were performed to determine the mRNA and protein expression of Arg-1，Fizz-1 and Ym-1 in M0 macrophages，M2 macrophages and M2 macrophages after hyperthermia（42 ℃），respectively．Transwell assay was utilized to measure the invasion and migration abilities of LCCs in LCCs+M2 and LCCs+M2+42℃ hyperthermia groups．Results　IFN-γ+LPS-and IL-4-induced RAW264.7 cells were successfully transformed into M1 and M2 macrophages，respectively．Flow cytometry results showed that the expressions of CD86 and CD206 in M2 macrophages were higher than those in M0 and M1 macrophages（P<0.001）．ELISA results revealed that the secretion level of IL-10 in M2 macrophages was higher than that of M0 and M1 macrophages（P<0.001）．The secretion level of IL-12 in M1 macrophages was higher than that of M0 and M2 macrophages（P<0.001）．Besides，we also found that the inhibition level of macrophages by hyperthermia at 42℃ was higher than that at 41℃ and 43℃（P<0.001）．RT-PCR results showed that M0 macrophages，the mRNA expressions of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in M2 macrophages were increased（P<0.001）．But the mRNA and protein expressions of Ym-1 and Arg-1 in M2 macrophages were decreased after hyperthermia（42 ℃，P<0.001）．In addition，compared with LCCs+M2 group，hyperthermia（42 ℃）significantly decreased the invasion and migration abilities of LCCs（P<0.001）．Conclusion　In summary，hyperthermia may inhibit the invasion and migration of LCCs by downregulating the mRNA expression of Arg-1 and Ym-1 in M2 macrophages．

Key words: Lung neoplasms, Neoplasms, Hyperthermia, RAW264.7, Macrophage polarization, Vitro techniques

饶紫琦,刘菁,陈炳林,等. 热疗对巨噬细胞M2极化作用及其对肺癌细胞侵袭、迁移影响的体外实验研究[J]. 中国全科医学, 2021, 24(17): 2207-2213. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.00.518.
RAO Ziqi,LIU Jing,CHEN Binglin, et al. Effect of Hyperthermia on M2 Polarization of Macrophages and Invasion and Migration of Lung Cancer Cells：an in Vitro Experimental Study　[J]. Chinese General Practice, 2021, 24(17): 2207-2213. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.00.518.

参考文献

［1］ADJEI I M，BLANKA S．Modulation of the tumor microenvironment for cancer treatment：a biomaterials approach［J］．J Funct Biomater，2015，6（1）：81-103．DOI：10.3390/jfb6010081．
［2］ALVAREZ M M，LIU J C，TRUJILLO-DE SANTIAGO G，et al．Delivery strategies to control inflammatory response：modulating M1-M2 polarization in tissue engineering applications［J］．J Control Release，2016，240：349-363．DOI：10.1016/j.jconrel.2016.01.026．
［3］SICA A，MANTOVANI A．Macrophage plasticity and polarization：in vivo veritas［J］．J Clin Investig，2012，122（3）：787-795．DOI：10.1172/JCI59643．
［4］康艳霞，张贺龙．肿瘤热疗机制的研究进展［J］．现代肿瘤医学，2008，16（3）：473-475．DOI：10.3969/j.issn.1672-4992.2008.03.065．http：//d.wanfangdata.com.cn/periodical/sxzlyx200803065．
［5］ITO A，KOBAYASHI T，HONDA H．A mechanism of antitumor immunity induced by hyperthermia［J］．Therm Med，2005，21（1）：1-11．DOI：10.3191/thermalmedicine.21.1．
［6］ANDO K，SUZUKI Y，KAMINUMA T，et al．Tumor-specific CD8-positive T cell-mediated antitumor immunity is implicated in the antitumor effect of local hyperthermia［J］．Int J Hyperth，2018，35（1）：226-231．DOI：10.1080/02656736.2018.1492027．
［7］REPASKY E A，EVANS S S，DEWHIRST M W．Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists［J］．Cancer Immunol Res，2013，1（4）：210-216．DOI：10.1158/2326-6066.cir-13-0118．
［8］SCHMITTGEN T D，LIVAK K J．Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T）method［J］．Nat Protoc，2008，3（6）：1101-1108．DOI：10.1038/nprot.2008.73．
［9］KUBOTA Y，TAKEDA T，TAKEDA T，et al．Combination of immunotherapy and hyperthermia［J］．Gan To Kagaku Ryoho，2019，46（10）：1605-1607．
［10］MOON E J，SONVEAUX P，PORPORATO P E，et al．NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species production activates hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）via the ERK pathway after hyperthermia treatment［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（47）：20477-20482．DOI：10.1073/pnas.1006646107．
［11］WINSLOW T B，ERANKI A，ULLAS S，et al．A pilot study of the effects of mild systemic heating on human head and neck tumour xenografts：analysis of tumour perfusion，interstitial fluid pressure，hypoxia and efficacy of radiation therapy［J］．Int J Hyperthermia，2015，31（6）：693-701．DOI：10.3109/02656736.2015.1037800．
［12］BERNARDO M E，FIBBE W E．Mesenchymal stromal cells：sensors and switchers of inflammation［J］．Cell Stem Cell，2013，13（4）：392-402．DOI：10.1016/j.stem.2013.09.006．
［13］SOLINAS G，GERMANO G，MANTOVANI A，et al．Tumor-associated macrophages（TAM）as major players of the cancer-related inflammation［J］．J Leukoc Biol，2009，86（5）：1065-1073．DOI：10.1189/jlb.0609385．
［14］ZHANG J，CAO J，MA S，et al．Tumor hypoxia enhances non-small cell lung cancer metastasis by selectively promoting macrophage M2 polarization through the activation of ERK signaling［J］．Oncotarget，2014，5（20）：9664-9677．DOI：10.18632/oncotarget.1856．

[1]	李芊芊, 陈循睿, 张文颖, 袁海花, 张燕捷, 姜斌, 刘峰. 晚期肿瘤患者化疗期间对社区卫生服务需求的调查及影响因素研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(33): 4173-4180.
[2]	高德康, 危少华, 马孝明, 杜鹏, 邢春根, 曹春. 肝癌大范围肝切除术后骨骼肌减少的危险因素及其与术后并发症的相关性研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(32): 4031-4037.
[3]	张继方, 陈芳, 唐佳雯, 李红亮. 肿瘤出芽及肿瘤浸润淋巴细胞对食管鳞状细胞癌淋巴结转移的预测价值研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(32): 4038-4042.
[4]	李雨荆, 晋一超, 陈醒, 嵇梦颖, 戴辉华. 服用他莫昔芬的乳腺癌患者宫腔镜检出子宫内膜病变的危险因素研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(32): 4026-4030.
[5]	张明, 许静, 孙振华, 赵文浩, 马樱倩, 张建桥, 沈海萍. 图像引导的光动力治疗改善老年重度梗阻食管癌患者营养状况的研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(30): 3780-3784.
[6]	李吉磊, 李洪霖, 许彦超, 刘亚南, 陈梦利, 邵帅, 马纯政. 消痰化瘀通噎颗粒配合通道开结丸联合化疗治疗食管癌的临床疗效研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(30): 3759-3764.
[7]	郑玉玲, 张亚玲, 刘怀民, 许彦超, 贾晓琳, 李军赛, 贺文龙, 仝新朵, 秦善文, 张丽涵. 丁香管食通含化丸单用及联合附桂管食通颗粒治疗晚期食管癌的临床研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(30): 3765-3771.
[8]	胡婧伊, 洪景, 郭晓冬, 张晓红, 莫宁, 周小翠, 余钦, 周敏华, 孙艳, 倪柳, 石晓丽, 苏小青, 李玉倩. 社区参与安宁疗护对临终期肿瘤患者干预效果的Meta分析[J]. 中国全科医学, 2023, 26(28): 3573-3584.
[9]	裴蓓, 成琳, 许凌云. 不同新辅助化疗方案对人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌患者免疫指标和肿瘤微环境的影响研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(27): 3435-3440.
[10]	高荣建, 吴海丽, 毕鑑红, 康凯, 郭星, 刘娟, 李晓丽, 孟存英. 胃黏膜病变内镜黏膜下剥离术后病理升级的相关因素分析[J]. 中国全科医学, 2023, 26(26): 3325-3329.
[11]	嵇梦颖, 李雨荆, 陈醒, 戴辉华, 孙莹. B超联合肿瘤标志物对卵巢黏液性肿瘤恶变的预测价值研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(24): 3022-3027.
[12]	王瑞, 王小梅, 彭国庆, 余欢, 王思涵, 夏瑾. 成人癌症恶病质的筛查评估与干预治疗——基于《成人癌症恶病质：ESMO临床实践指南》解读[J]. 中国全科医学, 2023, 26(23): 2823-2829.
[13]	赵泽玮, 康宁, 郭丰丽, 王钟玉, 郑向前. 极光激酶A表达对甲状腺髓样癌切除术后患者生化治愈的影响作用研究[J]. 中国全科医学, 2023, 26(20): 2508-2512.
[14]	薛珊, 李来有, 梁军利, 靳英辉, 魏淑艳. 家庭肠内营养在食管癌患者中有效性和安全性的Meta分析[J]. 中国全科医学, 2023, 26(20): 2540-2547.
[15]	张玉双, 孔令洋, 管佳畅, 李建波, 王一然, 王瑜, 李晶. 基于16S rDNA测序探索食管鳞状细胞癌患者肠道菌群特征[J]. 中国全科医学, 2023, 26(20): 2496-2502.