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           子点标记 N 蛋白抗原特异度结合，形成抗原 - 抗体复                         释后，进行喷金，喷量参数为 2.5 μl/cm。取出 NC 膜，
           合物继续向上层析，并与 NC 膜 T 线区域包被的鼠抗人                        剪成 300 mm/ 条，平整贴在 PVC 背板上，室温放置 30
           IgG 抗体结合，使 T 线位置受激发光激发显示出红色条                        ~60 min。将 N 蛋白 IgG 抗体（0.5 mg/ml）及鼠抗人 IgG
           带，而未与血清中抗体结合的量子点标记 N 蛋白抗原                           （0.5 mg/ml）利用喷金划膜仪划线（操作流程参考《三
           则继续向前层析，与 C 线包被的 N 蛋白抗体结合，使                         维划膜喷金仪操作流程》），划好的 NC 膜置于干燥箱
           C 线位置受激发光激发显示出红色条带（阳性）；若待                           中烘干。将干燥的吸水纸裁成 31.5 mm×300 mm 每条，
           测血清中无 N 蛋白 IgG 抗体则量子点标记抗原无法与 T                      贴在背板长端，在 NC 膜下端贴上金垫与样品垫，两端
           线包被的鼠抗人 IgG 结合，直接向上层析，与 C 线包被                       均压 NC 膜 1 mm，切成 3.88 mm 宽的试纸条，备用。
           的抗 N 蛋白 IgG 抗体结合，C 线位置受激发光激发显示                      1.4.3.2 量子点微球的筛选 选取迈瑞尔、昆道、
           出红色条带，而在 T 线位置无显色条带（阴性）。                            BRAVEOS、ACMES四家公司生产量子点，记作1号、2号、
           1.4 实验方法                                            3 号、4 号，静置 10 min 后 1 号量子点出现明显沉淀
           1.4.1 SARS-CoV-2  重 组 N  蛋 白 抗 原 的 制 备  核 酸         （图 1）。
           序 列 来 自 GenBank， 序 列 号：QQL14119.1， 氨 基 酸
           1-194；将序列送至测序公司进行合成，然后酶切连接
           至 pET28a 载体中。将连接成功、测序正确的载体命名
           为 pET28a-COV_N，将质粒转化至 BL21 大肠埃希菌中，                                                       混匀后
           待细菌生长至波长为 600 的吸光度（OD 值）为 0.06 时，
           加入0.05 mmol/L IPTG，在16 ℃条件下进行诱导表达8 h。
           4 000 r/min，30 min 收集菌体，加入裂解缓冲液，重悬
           菌体至无颗粒状，置冰上，超声破碎。18 000 r/min，
                                                                                                     混匀 10 min 后
           30 min 离心，收集上清。超声上清经过 0.45 μm 针孔
           过滤器进行过滤，用 5 倍柱体积裂解缓冲液平衡填料。
           将处理好的上清与平衡好的 Ni 柱 4 ℃结合 1.5 h，后转
           入重力柱内。连接恒流泵和蛋白检测仪，观察峰图收集                                              图 1 量子点微球
                                                                               Figure 1 Quantum dots
           流穿。用洗脱缓冲液对填料进行目的蛋白洗脱，分 5~8
           次，每次 1 倍柱体积洗脱缓冲液进行目的蛋白洗脱。收                              按照 1.4.3.1 标记量子点的方法分别用 4 种量子点
           集每次洗脱液，进行电泳鉴定。                                      标记 SARS-CoV-2N 蛋白抗原，并制成试纸条；向每个
           1.4.2 重组 N 蛋白抗原的 ELISA 试剂盒验证 将初始                    试纸条结合垫分别滴加 1.2 μl 5 倍稀释后的量子点标记
           浓度为 2 mg/ml 的 SARS-CoV-2 重组 N 蛋白用 coating           抗原溶液，用阳性标准品进行检测，得出 T、C 线荧光值，
           缓冲液稀释至 1μg/ml，用以制作蛋白工作液。设置 10                       每种实验条件设置 6 个平行，计算其 T 线荧光值平均值。
           孔（试剂盒的阳性标准品稀释 10 倍、20 倍、30 倍、40                     1.4.3.3 最适检测时间的确定 为了确定量子点试纸条
           倍、阴性对照，每浓度梯度设 2 个平行），用上述制备                          的最佳检测时间，取同一试纸条检测阳性血清标准品，
           好的工作液与 ELISA 试剂盒作对比，参照物为试剂盒                         每隔 30 s 测一次信号，记录数据，绘制曲线。
           内自带 N 蛋白包被的板孔，设定 12 孔（阳性标准品稀                        1.5 观察指标
           释 10 倍、20 倍、30 倍、40 倍、阴性对照、空白，每                     1.5.1 阴、阳性血清检测对比 应用制备好的试纸条检
           浓度梯度设 2 个平行）；实验方法参照试剂盒说明书，                          测阴、阳性标准血清（ELISA 试剂盒提供），加样 10 min
           450 nm 波长下测定 OD 值。                                  后用荧光检测仪检测荧光值，并置于紫外光灯下观察。
           1.4.3 量子点检测试纸条的制备及优化                                1.5.2 确定检测阈值（临界值） 取阴性样本血清，测
           1.4.3.1 试纸条的制备 用相应的处理液分别浸泡金标                        其 T、C 线荧光值，计算 T/C 线荧光比值（FIT/FIC 值），
           垫、样品垫后烘干，然后将其分别裁成尺寸适宜的小条，                           利用 SPSS（统计产品与服务解决方案）软件推算其中
           装入干燥剂并将袋口封紧备用；EDC/NHS 法活化量子                         离群样本，去除离群值，利用 SPSS 软件对其余数据进
           点微球，用 PBS（pH 值 6.0）反应缓冲液稀释 SARS-                    行探索性检验分析，确定此组数据是否为正态分布，确
           CoV-2 N 蛋白抗原，然后将活化后的量子点微球迅速加                        定临界值。
           入 SARS-CoV-2 N 蛋白中，混匀 37 ℃孵育 1 h；4 ℃，               1.5.3 试纸条灵敏度与重复性验证 利用 SARS-CoV-2
           14 000 r/min 离心 15 min，去上清；加封闭液（1% BSA              抗 N 蛋白 IgG 抗体〔85.3μg/g，中国计量科学研究院，
           溶液）200 μl，充分超声分散，孵育 2 h；根据比例稀                       编号：GBW（E）091110〕来验证试纸条的灵敏度。将
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