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           抗 N 蛋白 IgG 单克隆抗体标准品依次稀释为 1∶500、                     白进行对比验证结果显示：横坐标为阳性标准品稀释不
           1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000，每个稀释倍              同浓度（10 倍、20 倍、30 倍、40 倍）后样本、阴性标
           数 3 个重复，取同一批次制作的试纸条检测不同浓度结                          准品及空白孔，纵坐标为 OD 值（450 nm 波长下吸光
           果取均值。另抽取制备的 3 批次试剂卡，检测 1∶500、                       度），自制的 N 蛋白抗原包板与抗体结合，而且所测
           1∶2 000、1∶5 000 的 N 蛋白 IgG 抗体标准品，每个浓度               得阳性标准品结果（OD 值）均在 14.5 以上，比 ELISA
           平行检测 5 次，测其 T、C 线荧光值，计算 FIT/FIC 均值。                 试剂盒中原 N 蛋白抗原包板检测结果（OD 值最高 8.2）
           1.5.4 特异度验证 选取季节性冠状病毒 229E                          效果明显，说明纯化的 N 蛋白满足抗原抗体结合要求，
           （HD15OC2014）、NL63（HD15DE0922）、HKU1                  可以应用于免疫层析法检测的建立。见图 3。
           （HD15JA0702）、OC43（HD15JA0704）4 种分型的 N               2.2 量子点的筛选结果 用 4 种量子点标记 N 蛋白抗
           蛋白 IgG 抗体（均购自义翘神州公司）及支原体 P1 蛋                       原，分别制作试纸条，检测标定阳性血清，得出 T、C
           白、呼吸道合胞病毒 F0 蛋白、麻疹病毒 N 蛋白和风疹                        线荧光值，对比 T 线荧光值大小，筛选最优量子点，相
           病毒 E1 蛋白 IgG 抗体（睿信生物科技公司）验证试纸                       同条件下，4 种不同量子点标记的抗原试纸条 C 线及 T
           条的特异度。每种样本检测 3 次，测其 T、C 线荧光值，                       线的数值呈现差异，1 号量子点微球及 3 号量子点微球
           计算 FIT/FIC 均值。
                                                               a
           1.5.5 方法学比较 随机抽取本实验制备的 85 个试纸
           条与 SARS-CoV-2 抗体检测 ELISA 试剂盒（北京科卫
           临床诊断试剂有限公司）同时对 35 份 SARS-CoV-2 患
           者血清（血清由解放军疾病预防控制中心提供）和 50
           例正常人血清进行检测比较，同时对样本核酸检测结果
           （临床确诊）进行三方比较（PCR 核酸检测、ELISA 法、
           免疫层析试纸条）。
           1.5.6 稳定性实验 随机抽取同批次90条检测试纸条，
           置于 60.1℃烘箱中烘烤。依据阿伦尼乌斯公式设计实验，
                                                               b
           由其附表温度与老化天数关系表可知，37 ℃环境下保
                                                               75 kDa
           存 91 d 相当于常温（25 ℃）下 1 年的稳定性，等同于
           60.1 ℃环境下保存 9.3 d。因此，60.1 ℃需要测试的时
           间间隔为第 0天、第 1天、第 2天、第 4 天、第 8天（约
           为 25 ℃ 0 d、40 d、80 d、160 d、320 d）。每批次取出             25 kDa
           18 条试纸条，测量标准品抗体稀释 1∶500、1∶2 000、
           1∶5 000 三种浓度及三个阴性血清 1#、2#、3#，每个样
           本设 3 个平行，计算其 FIT/FIC 均值。
           1.5.7 测定标准曲线 根据确定好的实验条件制作试纸                            注：a 为色谱图；b 为 SDS-PAGE 电泳考染图：1 表示 Marker，2
           条，利用 SARS-CoV-2N 蛋白 IgG 抗体标准品（中国计                   表示纯化前超声上清，3 表示纯化流穿，4~5 表示 50 mM 咪唑洗脱，
                                                               6~10 表示 250 mM 咪唑
           量科学研究院，编号：GBW（E）091110）稀释不同浓度，
                                                                         图 2 蛋白洗脱峰和 SDS-PAGE 电泳图
           测量其 T、C 线荧光值，绘制散点图，推导标准曲线。                             Figure 2 Protein elution peak and SDS-PAGE electropherogram
           1.6 统计学方法 利用 SPSS（统计产品与服务解决方
           案）统计分析采集的阴性样本检测数据，绘制散点图，
           推算出其中离群值，去除离群值对其余数据进行探索性
           分析，判断此数据是否符合正态分布。计算第 95 百分
           位点，确定临界值。以 P<0.05 为差异有统计学意义。
           2 结果
           2.1 N  蛋白制备、纯化及验证结果 图 2a 峰图显示
           250 mmol/L 咪唑洗脱时有蛋白峰出现，SDS-PAGE 电泳
           图显示 IPTG 诱导后有分子量约为 21 kDa 的目的蛋白表
                                                                                   -1
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                                                                  注：10 、20 、30 、40 分别表示稀释 10、20、30、40 倍
           达，250 mmol/L 咪唑洗脱后目的条带单一，蛋白量多，                                图 3 N 蛋白 ELISA 试剂盒验证结果图
           杂带较少（图 3b）。将纯化的 N 蛋白与试剂盒中 N 蛋                              Figure 3 Validation results of N protein ELISA kit
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