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           院屏障环境动物实验室〔SCXK（京）2015-0001〕，室                      和清热消癥方亚组（QRXZF 亚组），每组 10 只。NC
           温 22~25 ℃，湿度 45%~60%，光照条件为明／暗交替                     组和 DKD 亚组大鼠灌服等量（1 ml/100 g）0.9% 氯化钠
           循环 12 h，大鼠自由饮水和饮食，适应性喂养 3 d。本                       溶液，1 次 /d。QRXZF 亚组大鼠以 7.92 g/kg 的剂量进
           实验由北京中医药大学东直门医院动物实验伦理委员会                            行中药灌胃，1 次 /d。干预期为 16 周。
           批准（编号：19-41）。                                       1.4.3 血、尿、肾组织标本留取和指标检测 干预期间
           1.2 实验试剂与仪器 链脲佐菌素（streptozotocin，                   每周测量各组大鼠体质量。干预 16 周末次给药后，测
           STZ）（ 货 号：s0130）， 购 自 美 国 Sigma 公 司； 柠              量大鼠体质量，收集大鼠 24 h 尿液记录尿量，离心转
           檬酸缓冲液（货号：C1013）、Masson 染液（货号：                       速为 3 000 r/min，离心半径 13.5 cm，4 ℃离心 10 min 后，
           G1346）和糖原（PAS）染色液试剂盒（货号：G1281）                      采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定大鼠尿微量白蛋
           购自索莱宝公司；苏木素 - 伊红（H-E）染液（货号：                         白，根据尿量计算大鼠 24 h 尿微量白蛋白。打开大鼠
           D006-1-2）购自南京建成生物工程研究所；尿微量白                         腹腔，腹主动脉取血，离心条件同前，离心 10 min 后，
           蛋 白 试 剂 盒（ 货 号：ab235642）、p16 抗 体（ 货 号：              取上层血清，全自动生化分析仪测量各组大鼠血肌酐
           ab51243）购自美国 Abcam 公司；Caspase-3 抗体（货                （Scr）、血清尿素氮（BUN）和血清白蛋白（ALB）；
           号：19677-1-AP）购自 Proteintech 公司；一步法原位                摘取肾脏并称量肾脏重量，各组大鼠只留取左肾作为标
           末端脱氧核苷酸转移酶标记技术（TUNEL）细胞凋亡检                          本，肾重指数 = 肾脏重量 / 体质量 ×1 000。肾组织石
           测试剂盒（货号：C1088）、蛋白酶 K（货号：ST532）                      蜡包埋，切成厚度 2 µm 的切片备用。
           购自上海碧云天生物科技有限公司；山羊血清（ZLI-                           1.4.4 HE 染 色 HE 染 色 具 体 步 骤 如 下：（1） 肾
           9056）、内源性过氧化物酶阻断剂、反应增强液、增强                          组织石蜡切片于 60  ℃烤片机烤片 1 h，新鲜二甲苯
           酶标山羊抗兔 / 鼠 IgG 聚合物（PV-9001/PV-9002）、                Ⅰ / Ⅱ / Ⅲ 脱 蜡 3 次，10 min/ 次。（2）100%、95%、
           荧光封片剂（含 DAPI）（ZLI-9557）、中性快干胶封                      80%、75% 梯度乙醇水化各 3 min，磷酸盐缓冲液（PBS）
           片剂（ZLI-9516）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。                       洗 3 次，5 min/ 次。（3）苏木素染细胞核 5 min，自
           AU480 全自动生化仪（日本奥林巴斯）全自动组织处理                         来水冲洗 2 min，1% 盐酸乙醇分化 3 s，自来水冲洗
           系统（美国美天旎公司），RM2135 病理切片机，烤片                         15 min， 返 蓝。（4） 伊 红 染 色 8 min，95%、95%、
           机（德国 Leica 公司），BX60 型显微镜（日本 Olympus                 100%、100% 梯 度 乙 醇 脱 水 各 3 min。（5） 二 甲 苯
           公司）。                                                Ⅰ / Ⅱ / Ⅲ各透明 1 次，10 min/ 次。中性树胶封固，通
           1.3 中药制备 清热消癥方药物组成：黄芪 30 g、黄                        风橱晾干后，在光镜下对肾脏组织切片进行观察和分析。
           蜀葵花 30 g、熟大黄 3 g、黄芩 10 g、水蛭 5 g、土鳖虫                 1.4.5 PAS 染 色 PAS 染 色 具 体 步 骤 如 下：（1） 肾
           10 g，购自北京中医药大学东直门医院中药库，中药煎                          组织常规烤片、脱蜡、水化同上，双蒸水浸洗 2 次，
           煮后水浴浓缩为 1 g/ml，4 ℃冷藏备用，水煎煮和浓缩                       5 min/ 次。（2）滴加氧化剂室温反应 8 min。自来水冲
           程序按照《中国药典》2010 版规定执行。采用体表面                          洗 1 次，蒸馏水浸洗 2 次。（3）滴加 Schiff 染液，避光
           积系数换算大鼠灌胃给药剂量，以成年人 70 kg，大鼠                         浸染 20 min。自来水冲洗 10 min。苏木素染核 2 min。
                                                     -1
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           200 g，换算系数6.3计算     ［17］ ，中药浓度为7.92 g·kg ·d 。       酸性分化液分化 2 s。自来水冲洗 10 min 返蓝。脱水、
           1.4 实验方法                                            透明同前，树胶封固。PAS 染色后，每张切片随机挑选
           1.4.1 DKD 大鼠模型建立 30 只大鼠适应性喂养 3 d                    至少 3 个 200 倍视野并采集图像进行肾小球硬化水平评
           后，随机分为假手术组（NC 组，n=10）和模型组（n=20）。                    分。评分标准如下：0 分，无硬化症；1 分，≤ 10% 的
           在 NC 组大鼠右肾体表解剖位置，做长约 1 cm 的横行切                      肾小球硬化；2 分，>10%，≤ 25% 的肾小球硬化；3 分，
           口并缝合。模型组大鼠予右侧肾切除，1 周后观察伤口                           >25%~50% 的肾小球硬化；4 分，>50% 的肾小球硬化。
           愈合后，腹腔注射 STZ 造模。55 mg STZ 溶解于柠檬酸                    1.4.6 Masson 染色 Masson 染色具体步骤如下：（1）
           缓冲液中，配置成 1% 的 STZ 溶液。根据参考文献                ［18-19］   肾组织常规烤片、脱蜡、水化同上，媒染液室温过夜媒
           的方法，将模型组 20 只大鼠禁食不禁水 12 h 后，单次                      染。（2）次日流水冲洗 10 min，滴加天青石蓝染色液
           腹腔注射 STZ（55 mg/kg）构建 DKD 模型。NC 组大鼠                  染色 2~3 min，水洗 2 次，15 s/ 次。（3）Mayer 苏木素
           注射等体积柠檬酸缓冲液。3 d 后测定模型组大鼠尾静                          染核 3 min，双蒸水洗 2 次，10~15 s/ 次。酸性乙醇分
           脉血糖，留取 DKD 模型大鼠 24 h 尿液，若随机血糖                       化液分化 3 s 至组织完全变红，水洗终止分化，双蒸水
           >16.7 mmol/L，24 h 尿蛋白定量 >30 mg/L，则表明 DKD            冲洗 10 min。（4）丽春红染色 10 min，双蒸水洗 2 次，
           模型建立成功。                                             15 s/ 次。（5）磷钼酸溶液处理约 10 min。倾去上液，
           1.4.2 分组及给药 将模型组大鼠随机分为 DKD 亚组                       滴加苯胺蓝染色液染色 5 min。（6）弱酸溶液洗去苯胺
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