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蓝后，继续滴加弱酸处理 2 min。（7）脱水、透明、封 表 1 各组大鼠体质量、肾重指数水平比较（ ±s）
Table 1 Comparison of body weight and kidney weight index in rats in
固同前。每张切片随机挑选至少 3 个 200 倍视野并采集
control group，DKD and QRXZF subgroups
图像，使用 Image-Pro Plus 6.0 软件检测肾脏组织蓝色
组别 只数 体质量（g） 肾重指数（%）
胶原纤维面积百分比。 NC 组 6 488.83±36.71 2.80±0.10
1.4.7 免 疫 组 化 法（IHC） 检 测 肾 组 织 中 p16 和 DKD 亚组 6 230.33±38.61 a 11.11±0.93 a
Caspase-3 表达 IHC 具体步骤如下：（1）肾组织常规 QRXZF 亚组 6 318.67±40.89 ab 9.13±1.04 ab
烤片、脱蜡和水化。（2）95 ℃的柠檬酸盐抗原修复液 F 值 68.92 127.93
修复 20 min。（3）滴加 100 µl 内源性过氧化物酶阻滞 P 值 <0.01 <0.01
剂，室温孵育 10 min；PBS 洗 5 min，重复 3 次。（4） 注：NC 组 = 假手术组，DKD 亚组 = 糖尿病肾病亚组，QRXZF 亚
a
b
组 = 清热消癥方亚组； 表示与 NC 组相比 P<0.01， 表示与 DKD 亚
100 µl 山羊血清，湿盒中 37 ℃封闭 30 min。（5）滴
组相比 P<0.01；因血清样本时有溶血，以及剔除异常值后，为保证各
加 p16（1∶50）和 Caspase-3 抗体（1∶100），湿盒中 组样本量一致，各组选取样本时 n=6
4 ℃冰箱孵育过夜。（6）次日恢复室温 20 min，滴加
100 µl 反应增强液剂，37 ℃孵育 30 min。PBS 洗 3 次， 组 24 h 尿微量白蛋白、Scr、BUN 水平均高于 NC 组，
5 min/ 次。（7）滴加羊抗兔或者羊抗小鼠二抗，37 ℃ ALB 水平低于 NC 组（P<0.01）；QRXZF 亚组 24 h 尿
孵育 30 min 后 PBS 洗涤，方法同上。（8）DAB 染色约 微量白蛋白、BUN 水平均高于 NC 组，ALB 水平低于
1 min，用双蒸水终止反应后，苏木素染核 8 min。脱水、 NC 组（P<0.01）；QRXZF 亚组 24 h 尿微量白蛋白、
透明、封固同前。每张切片随机挑选至少 3 个 200 倍视 Scr、BUN 水平均低于 DKD 亚组，ALB 水平高于 DKD
野并采集图像。p16 和 Caspase-3 阳性表达通过 Image- 亚组，差异均有统计学意义（P<0.01），见表 2。
Pro Plus 6.0 软件进行半定量分析，检测累积光密度值
表 2 各组大鼠 Scr 、BUN、ALB 和 24 h 尿微量白蛋白水平比较
（IOD）和阳性面积（Area），取二者比值为表达水平。
（ ±s）
1.4.8 TUNEL 法检测肾小管细胞凋亡率 （1）肾组 Table 2 Comparison of the levels of Scr，BUN，ALB and 24 h Upro in
织常规烤片、脱蜡和水化。（2）滴加 20 µg/ml 不含 rats in control group，DKD and QRXZF subgroups
DNase 的蛋白酶 K〔碧云天 ST532/ST533 蛋白酶 K（20 组别 只 24 h 尿微量白 Scr BUN ALB
mg/ml），用 P0106 免疫染色洗涤液或 10 mmol/L Tris- 数 蛋白（mg/L） （µmol/L） （mmol/L） （g/L）
NC 组 6 20.35±5.00 27.50±4.22 5.41 ± 0.28 27.9±1.95
HCl pH 7.4~7.8 稀释 1 000 倍即为 20 µg/ml 不含 DNase
DKD 亚组 6 68.15±12.70 a 44.45±6.46 a 24.47±3.06 a 22.55±0.69 a
的蛋白酶 K〕，20~37 ℃作用 15 min。（3）PBS 洗涤 3
QRXZF 亚组 6 41.19±7.0 ab 31.90±4.09 b 14.40±2.60 ab 25.68±1.16 ab
次。在样品上加 50 µl TUNEL 检测液，37 ℃避光孵育
F 值 26.55 10.22 54.98 23.09
60 min。PBS 洗涤 3 次。（4）含 DAPI 的抗荧光淬灭封
P 值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
固液封片后荧光显微镜下观察。每张切片随机挑选至少
a
注：Scr= 血肌酐，BUN= 尿素氮，ALB= 白蛋白； 表示与 NC 组
3 个 400 倍视野并采集图像。通过 Image J 对绿色凋亡
b
相比 P<0.01， 表示与 DKD 亚组相比 P<0.01；因血清样本时有溶血，
细胞和蓝色细胞核进行细胞计数，取二者比值的百分数 以及剔除异常值后，为保证各组样本量一致，各组选取样本时 n=6
为凋亡率。
1.5 统计学方法 采用 SPSS 27.0 软件进行数据统计分 2.3 各组大鼠肾脏组织病理染色结果
析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素 2.3.1 HE 染色结果 HE 染色可见：DKD 亚组肾小球
方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。以 P<0.05 肥大，系膜细胞及系膜基质增生，肾小管上皮细胞空
为差异有统计学意义。 泡变性；QRXZF 亚组大鼠肾脏病理变化程度明显轻于
2 结果 DKD 亚组；NC 组大鼠肾小球、肾小管及系膜基质未见
2.1 各组大鼠体质量和肾重指数结果 各组大鼠体质 明显病理变化，详见图 1。
量和肾重指数比较，差异均有统计学意义（P<0.01）； 2.3.2 PAS 染色结果 PAS 染色可见：NC 组大鼠肾小
其中 DKD 亚组、QRXZF 亚组体质量均低于 NC 组，肾 球均匀光滑，肾小管基膜及系膜基质无明显病理性改变，
重指数均高于 NC 组（P<0.01）；QRXZF 亚组体质量高 肾小球血管袢薄，未见肾小球肥大及肾小管管型。DKD
于 DKD 亚组、肾重指数低于 DKD 亚组（P<0.01），差 亚组大鼠肾组织损伤明显，肾小球基底膜明显增厚，系
异均有统计学意义，见表 1。 膜细胞及基质增多，部分肾小管出现空泡样病变，管腔
2.2 各组大鼠 24 h 尿微量白蛋白、Scr、BUN 和 ALB 扩张，可见肾间质水肿。QRXZF 亚组大鼠肾小球基底
结果 各组大鼠 24 h 尿微量白蛋白、Scr、BUN 和 ALB 膜较 NC 组轻度增厚，肾小管管腔轻度扩张，系膜细胞
比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中 DKD 亚 增多不明显，详见图 1。对 PAS 染色进行量化评分发现，