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2023年3月   第26卷   第8期                                 http: //www.chinagp.net   E-mail: zgqkyx@chinagp.net.cn  ·941·

           代谢活跃的内分泌和旁分泌器官              ［3］ 。心外膜脂肪组织            interaction，PPI）网络的构建与 hub 基因筛选 将所选
           （epicardial adipose tissue，EAT）在解剖上与冠状动脉            基 因 导 入 STRING 数 据 库（https://string-db.org） 构 建
           紧密相连，同 AS、心房颤动、心力衰竭等 CVD 密切相                        PPI 网络，将 PPI 网络导入 Cytoscape（Version 3.9.0）软
           关 ［4-6］ 。多项研究发现功能失调的 EAT 通过分泌外泌                     件 ［11］ 通过 CytoHubba 插件 MCC 算法获得连接度最高
           体（exosome，EXO）和生物活性物质促进 AS 疾病进展             ［7］ ，   的 10 个基因作为关键基因，并进行绘图。
           但其作用机制仍需进一步研究。本研究通过对美国国                             1.6  免 疫 细 胞 浸 润 分 析  在 Cibersort 网 站（https://
           家生物技术信息中心（NCBI）的基因表达综合数据库                           cibersort.stanford.edu/）下载 22 种免疫细胞的基因表达
           （Gene Expression Omnibus database，GEO） 中 CAD 患      矩阵，采用 Cibersort 反卷积算法，计算 GSE64554 芯片
           者 EAT 和 EXO 的基因测序数据进行生物信息学分析，                       中 46 个样本的免疫细胞浸润情况，并作图对组织的免
           探讨 EAT 参与 AS 的分子机制及其与 EXO 的联系，旨                     疫细胞浸润情况进行比较。
           在为 CAD 的诊断和治疗提供新的理论基础。                              1.7 临床样本的采集及实时荧光定量 PCR（quantitative
           1 材料与方法                                             real-time PCR，qRT-PCR） 选取山西医科大学第二医
           1.1 数据集的下载与预处理 以“epicardial adipose                 院 2021 年 6—10 月行冠状动脉造影患者 20 例，其中
           tissue OR EAT”为关键词，选择“Homo sapiens”为研               CAD 患者及健康者各 10 例，留取外周血储存在 -80 ℃
           究对象检索 GEO 数据库，根据数据集提供的相关信息，                         冰箱中备用。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，
           获得所需芯片 GSE64554、GSE120774，根据临床信息                    见表 1。按照总 RNA 快速提取试剂盒（RP4001，百泰
           将 EAT 的测序数据分为 CAD 组和健康对照组。下载                        克公司）的说明提取血浆中的总 RNA，cDNA 的合成按
           series matrix 的数据，采用“sva”包“ComBat”方法去               照 HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试
           除批次效应，合并基因表达矩阵。通过 exoRBase 2.0 数                    剂盒的步骤进行，第一步去除总 RNA 中残余的 DNA，
           据库获取 CAD 组与健康对照组血液 EXO 基因表达谱。                       第二步反转录 cDNA，得到的 cDNA 保存于 -20 ℃冰箱。
           1.2 差异基因的筛选 通过“limma”R 语言包               ［8］ 对合     以 cDNA 为模板，进行 qRT-PCR，反应程序为：95 ℃
           并后数据集中 CAD 组与健康对照组 EAT 间差异表达基                       3 min；95 ℃ 5 s；60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40 个循环；95 ℃
           因（differentially expressed genes，DEGs） 和 CAD 组 与    15 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s。结果用 2 -ΔΔCT  进行计算分析。
           健康对照组 EXO 间 DEGs 进行筛选，以 P<0.05 为筛选                  1.8 统计学方法 采用 Excel 对录入整理数据，应用
           条件，并将结果可视化为火山图和热图。                                  SPSS 26.0 软件对数据进行统计学分析，符合正态分布
                                                                               -
           1.3 加权基因共表达网络（WGCNA）的构建与 CAD                        的连续变量采用（x±s）表示，两组间比较采用独立样
           相关模块的识别 为了防止合并数据集对基因关联度的                            本 t 检验，以 P<0.05 为差异有统计学意义。
           影响，使用“WGCNA”R 语言包构建 GSE64554 数据                     2 结果
           集基因共表达网络并识别出模块。选择满足无尺度网络                            2.1 CAD 组与健康对照组 EAT 间的 DEGs
           的标准软阈值 β 构建基因共表达网络，转化拓扑重叠                           2.1.1 DEGs 的获取 采用“limma”包获取 CAD 组与
           矩阵（topological overlap matrix，TOM），采用动态剪            健康对照组 EAT 间 DEGs，以 P<0.05 作为筛选差异基
           枝法对模块进行初步划分。根据 GSE64554 数据集样本
                                                                                 表 1 PCR 引物
           临床信息，决定纳入的临床信息包括疾病和年龄，得到
                                                                         Table 1 Primer sequences for qRT-PCR
           相关性最高的模块进行后续分析。计算基因与模块的相                                                               产物长度   退火温度
                                                                  引物名称             引物序列
           关系数（module membership，MM）来评估基因与模块                                                       （bp）   （℃）
           之间的相关性，以 |MM|>0.8 筛选模块内枢纽基因（hub                        H-BPI-S   GAATCAACTATGGTCTGGTGGCA  106  60.62
           gene）。                                                 H-BPI-A    AAGGGAGGTGGATTGTGGTG
                                                                 H-BIRC5-S  CGCATCTCTACATTCAAGAACTGG  182  59.73
           1.4 基因功能的富集分析 通过“clusterProfiler”R 语
                                                                 H-BIRC5-A    GGTTTCCTTTGCATGGGGT
           言包  ［9］ 将所获基因进行富集分析，以 FDR<0.05 为筛选
                                                                 H-CXCL12-S  TGAGCTACAGATGCCCATGC   137   60.18
           标准，进行通路富集分析。通过 GO 富集分析，得到所
                                                                H-CXCL12-A  GCACACTTGTCTGTTGTTGTTCTTC
           选基因所富集的生物过程（biological process，BP）、细                 H-RNASE1-S   GCTCCTTCTGCTTGTCCTGAT  149   60.07
           胞组分（cellular components，CC）及分子功能（molecular           H-RNASE1-A  TCATCATTTGGTTACAGTAGGTGGA
           function，MF）。通过 KEGG 通路富集分析，得到所选                       H-F2R-S    CAGTGATTGGCAGTTTGGGTCT  270  61.08
           基因所富集的信号通路。将所获基因导入 Metascape 在                         H-F2R-A   TGACAGGTAGTGATGTTGAGCCC
           线数据库    ［10］ 进行基因的富集分析以及转录因子预测。                       H-ACTIN-S  CACCCAGCACAATGAAGATCAAGT  317  61.60
           1.5  蛋 白 质 - 蛋 白 质 相 互 作 用（protein-protein            H-ACTIN-A  CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC
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